浅谈PCR反应体系构建设计中的重要要素--引物

　　PCR具有突出的优势，如特异性，灵敏度，高产率，快速，简便，可重复性好，易于自动化。它可以在试管中分析待研究的靶基因，或者可以在几个小时内将某个基因片段扩增到十万甚至一百万次，使肉眼可以直接观察判断。从头发，一滴血甚至是细胞中提取的DNA都可以扩增出足够数量的DNA用于分析研究和测试鉴定。PCR技术是生物医学领域的一项举措和里程碑。因此，PCR反应体系构建是非常必要的。

　　PCR反应的五个要素：参与PCR反应的五种主要物质，即引物，酶，dNTP，模板和Mg2+。引物是在PCR反应体系构建特定反应的关键。PCR产物的特异性取决于引物和模板DNA之间的互补程度。从理论上讲，只要您知道任何模板DNA序列，就可以设计一条互补的寡核苷酸链作为引物，并使用PCR在体外扩增模板DNA。
 

　　PCR反应体系构建设计中引物应遵循什么原则？

　　1、引物长度：15-30bp，通常在20bp左右；

　　2、引物扩增范围：200-500bp为宜，具体条件可扩增大10kb的片段；

　　3、引物碱基：40％-60％的G+C含量合适，G+C太少，扩增效果差，G+C太容易出现非特异性条带。ATGC是随机分布的，避免了5种以上的电子核苷酸啸叫或字符串排列；

　　4、避免引物的二级结构，避免两个引物之间的互补，尤其是3'末端互补，否则会形成引物二聚体以产生非特异性扩增条带；

　　5、引物3'末端的碱基，尤其是后一个和倒数第二个碱基，应严格配对，以避免末端碱基的碱基错配导致PCR失败。

　　6、引物具有或可以加入合适的限制位点。扩增的靶序列应具有合适的限制位点。这适合进行限制性分析或分子克隆非常有益；

　　7、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库中的其他序列没有明显的同源性。